双通道实时荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌药物耐药相关基因突变
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【摘 要】目的基于双标记荧光探针熔解曲线分析技术,建立一种利用实时荧光PCR快速检测结核分枝杆菌耐药突变的方法。方法根据结核分枝杆菌一线药物常见耐药突变位点(包括rpoB81bp耐药决定区、inhA启动子、katG315、ahpC启动子以及embB306)设计6条荧光双标记探针和对应引物,通过PCR扩增耐药突变位点所在基因片段,在扩增完成后通过熔解曲线检测分析实现对耐药突变的快速检测。通过对2008年上海市疾控中心收集的76株临床耐多药(MDR)菌株进行检测,验证本方法的敏感度和特异度。结果本方法成功从76株MDR菌株中检测出相关耐药突变,各种突变对应△Tm值范围为1.8~14.4℃。将检测结果和测序结果对比表明该方法检测敏感度和特异度都为100%(rpoB,80/80;inhA,7/7;katG315,59/59;ahpC,8/8;embB306,27/27)。本方法可以成功从最低浓度为100拷贝/μl的结核分枝杆菌DNA样本中准确地检测耐药突变。结论双通道实时荧光PCR熔解曲线法可以快速灵敏地检测结核分枝杆菌常见耐药突变。该方法具有检测迅速准确、结果易判读、交叉污染概率低等特点,可用于快速检测临床结核耐药相关的基因突变,并对结核耐药情况进行评估。(中华检验医学杂志.2013.36:63-67)
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